近幾年，細胞和基因zhiliao（cell & gene therapy，CGT）領域發展迅猛，在多個方向取得了重大突破，以anti-CD19和BCMA為代的多種CAR-T免疫細胞療法攻克了一部分血液瘤，多種AAV療法也給一些難以成藥的罕見病提供了有效的zhiliao方案。另一方面，基于CRISPR基因編輯技術的眾多基因療法也進展迅速，較早體外基因編輯療法較快今年年底能夠上市（CRISPR Therapeutics CTX001），體內基因編輯療法取得了不錯的臨床數據（Intellia Therapeutics NTLA-2001），使用CRISPR技術制造的通用型CAR-T療法也是免疫細胞療法發展的一大趨勢（Caribou Biosciences CB-010）。脫靶檢測在揭示CRISPR/Cas9系統的脫靶機制以及進一步提高系統靶向性的研究中具有重要作用。溫州基因編輯脫靶檢測安全性評價

GUIDE-Seq脫靶評估技術的優勢分析鼓潤致力于基因組編輯工具脫靶的分析檢測工作，為篩選、優化基因組編輯工具的保真性提供標準化的分析。我們脫靶分析具有如下優勢：實用性強：能反映CRISPR在真核細胞中進行基因編輯的在靶與脫靶情況，以進行安全性和有效性評價；檢測通量高：一次能檢測多個樣本的在靶與脫靶情況，并通過優化的標簽設計，降低實際的測序reads數量；準確性高：絕大部分檢測結果可被驗證；靈敏度高：能夠高效檢測出低頻脫靶位點，檢測低至0.1%的脫靶突變；實驗難度低：操作過程簡單易行細胞適應性強。off-target脫靶檢測方法如何檢測是否發生脫靶？

通常不需要進行標準的遺傳毒性組合試驗，但應根據基因zhiliao產品的特點、產品的具體適應癥、載體的已有信息、導入基因序列結構等，評估基因zhiliao產品整合進基因組的可能性，判斷是否需要開展另外的遺傳毒性研究，如研究基因組修飾的發生情況，并檢測隨后可能發生的異常細胞行為；評估插入突變（插入位點、插入拷貝數等）引起的遺傳毒性風險。當基因zhiliao產品采用基因編輯或轉座子技術時，需要關注脫靶編輯、轉座子轉座印跡引起的遺傳毒性問題；鑒定/表征基因組整合位點。

由于設計的sgRNA會與非靶點DNA序列錯配，引入非預期的基因突變，即脫靶效應(Off-targeteffects)。脫靶效應造成了研究中的許多不確定性，這無疑限制了該技術的應用。因此，研究者希望能開發有效的方法來檢測脫靶效應。在目前主流的脫靶效應評估方法中，有一種方法為GUIDE-seq，其原理是利用一種短的雙鏈寡聚核苷酸（dsODN）標記CRISPR/Cas誘導的脫靶斷裂，然后對標簽所在的基因組區域進行高通量測序，通過生物信息學分析從而確定脫靶位點。利用該技術可以在基因組范圍內檢測CRISPR脫靶效應，從而改變了以往先預測假定脫靶位點再檢測的思路；與其他的評估方法相比，GUIDE-seq更精確、更靈敏。基因編輯可以‘指哪打哪’,四種脫靶檢測方法。

Cas9蛋白是一種切割外來DNA的酶，像一把分子剪刀。該蛋白通常與兩個RNA分子結合：crRNA和另一個稱為tracrRNA（或“反式jihuocrRNA”）。這兩個RNA分子引導Cas9到它將進行切割的目標部位。這段DNA是與crRNA的20個核苷酸互補的。CRISPR技術是從細菌和古細菌的自然防御機制中改編而來的。這些生物體使用CRISPR衍生的RNA和各種Cas蛋白，包括Cas9，來阻止病毒和其他異物的攻擊。它們主要通過切碎和破壞外來入侵者的DNA來做到這一點。當這些組件被轉移到其他更復雜的生物體中時，它允許對基因進行操縱，或“編輯”。脫靶切割位點已在基因編輯技術,CRISPR / Cas9,ZFNs和TALEN。上海定量脫靶檢測評估標準

種子基因脫靶檢測機構推薦唯可。溫州基因編輯脫靶檢測安全性評價

對于基因修飾細胞zhiliao產品，充分的非臨床研究是為了：（1）闡明基因修飾的目的、功能以及產品的作用機制，明確其在擬定患者人群中使用的生物學合理性；（2）為臨床試驗的給藥途徑、給藥程序、給藥劑量的選擇提供支持性依據；（3）根據潛在風險因素，闡明毒性反應特征，預測人體可能出現的不良反應，確定不良反應的臨床監測指標，為制定臨床風險控制措施提供參考依據。因此，應充分開展非臨床研究，收集用于風險獲益評估的信息，以確立擬開發產品在目標患者人群中預期具有合理的、可接受的獲益風險比，同時為臨床試驗的設計和風險控制策略的制定提供支持性依據。溫州基因編輯脫靶檢測安全性評價

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