gRNA的長度和錯配： 17個核苷酸長度的gRNA顯示出更高的基因組編輯效率。相比之下，18-20 bp的長度顯示出較低的基因組編輯效率。在人類細胞中減少潛在脫靶效應的指導方針：1) 應避免在PAM的7-10 bp范圍內靶序列有超過3個錯配；2) 在PAM的12 bp內，應避免sgRNA 凸起以減少脫靶效應。gRNA的化學修飾：在gRNA核糖磷酸骨架中加入2?-O-甲基-3?-膦?；宜狨е挛稽c特異性修飾，使脫靶切割減少40-120倍，同時保持靶向性能。gRNA上游5'發夾結構的修飾可以提高Cas9和Cas12的特異性，降低脫靶效應。如何降低脫靶效應？選擇特異的gRNA； 使用RNP； 使用eSpCas9的質粒； 使用Nickase Cas9。江蘇基因療法脫靶檢測技術

CRISPR基于sgRNA與基因組序列互補定位到靶位點，不論哪種CRISPR系統，都存在sgRNA序列不完全匹配但能夠結合基因組的脫靶現象，CRISPR定位到脫靶位點引發序列改變就屬于第二類風險。CRISPR技術誕生剛過10年，期間迅速取代TALEN和ZFN，成為學術界通用的基因編輯技術，也徹底改變了我們的生物學研究方法。為提高CRISPR技術的安全性，特別是往臨床應用發展時的安全性問題，研究者們一直以提高靶位點的編輯效率和準確性，同時降低脫靶位點編輯發生概率為目標，來優化CRISPR技術。另一方面，研究者們也開發了大量檢測方法，用于檢測CRISPR的靶向風險和脫靶風險，用于早期sgRNA序列的篩選，以期望獲得一個較為安全的sgRNA。臺州crispr/cas9脫靶檢測實驗室基因編輯脫靶檢測，推薦唯可生物，實驗實力強，專業性高，檢測效率高，結果準確率高。

細胞外檢測方法：細胞外檢測方法較為直接，將基因組提純后進行CRISPR體外切割實驗，再捕獲發生脫靶切割的位點即可。1) Digenome-seqDigenome-seq是較早提出的一類細胞外脫靶位點檢測方法，提純的基因組DNA被Cas9/sgRNA切割后，再經過標準的全基因組測序流程獲得測序數據，之后需要較為復雜的生物信息學分析才能夠獲得CRISPR切割位點的信息?？傮w來講，這種方法測序成本較高，并且檢測靈敏度也有限。2)SITE-seq為了有效檢測到低頻脫靶位點，一般需要在建庫時定向捕獲CRISPR切割位點。SITE-seq就是這樣一種測序方法，提純的基因組DNA經過Cas9/sgRNA切割后，在切割位點末端連接帶Biotin的接頭；再隨機打斷基因組，在另一端連接第二個接頭；經過鏈霉親和素磁珠純化，只有一輪被Cas9切割的DNA才能夠被純化并測序，實現了CRISPR切割位點的富集。該方法雖然提高了脫靶位點的檢測靈敏度，但有著較高的實驗要求，每次需要投入大量的基因組DNA，并且無法區分提純基因組DNA時發生的隨機斷裂和Cas9的切割，導致產出較為明顯的背景信號。同時，由于一輪Biotin接頭只會接在Cas9切割位點的一側，導致測序結果里只能看到脫靶位點一側的序列。

脫落與傳播。對于部分有ganran或復制能力的基因zhiliao產品，從受試者者體內排出或脫落到自然環境后，可能會傳播給受試者的密切接觸者，包括患者親屬和醫護人員等，進而產生病毒傳播或ganran風險。其他考慮因素。除產品相關因素外，基因zhiliao產品的長期風險評估還應考慮靶細胞/組織/qiguan，患者群體（年齡、免疫狀態、死亡風險等）和相關疾病的特征以及合并其他zhiliao的影響。如果基因zhiliao產品可在生殖腺、生殖細胞等組織qiguan中分布并發揮作用，可能對受試者或其配偶的生育能力、妊娠以及胎兒產生難以預測的遲發性影響。預算允許的情況下，通過全基因組測序的方法進行全基因組序列的分析和比對更精細，如基于NGS的iGUIDE方法。

脫靶來自于這些技術所攜帶的功能基團，如堿基編輯的脫氨酶和先導編輯的逆轉錄酶，不依賴sgRNA結合基因組DNA的情況下產生的脫靶。為檢測第二類脫靶現象，研究者需要針對每種技術設計專門的檢測方法。1) R-loop seq在堿基編輯開發早期，雖然靶位點的編輯效率很高，但研究者也很快發現脫氨酶會在游離的時候隨機修飾暴露的DNA單鏈，導致大量的脫靶位點。為降低這類脫靶現象的發生，研究者設計了R-loop seq，以dSaCas9結合DNA形成R-loop，暴露出DNA單鏈，為堿基編輯的脫氨酶提供一個固定的脫靶位點，然后以該位點的編輯效率反映堿基編輯脫氨酶的脫靶程度。通過對DSB的標記實現了全基因組無偏脫靶檢測，如IDLVs、BLESS、GUIDE-seq技術等。嘉興育種脫靶檢測方法

根據選擇的sgRNA，通過生物信息學方法，對sgRNA進行脫靶分析。江蘇基因療法脫靶檢測技術

圍繞大家關心的CRISPR基因編輯安全性問題，我們首先對CRISPR脫靶位點檢測技術進行一次大盤點，在sgRNA設計階段需要如何做才能夠盡可能地避免脫靶現象的發生。較簡單的脫靶位點檢測方法是全基因組測序（WGS），但在實際使用中，即使測序深度達到100X，也很難發現一些低頻率的脫靶位點，同時測序成本卻非常高。為彌補WGS的這些缺陷，常見的脫靶位點檢測技術都需要對脫靶位點進行捕獲富集，來提高檢測靈敏度，降低測序成本。按照實驗原理的不同，脫靶位點檢測技術可以分為細胞外、細胞內和其他特殊方法這3類。江蘇基因療法脫靶檢測技術