細胞內鈣離子作為重要的信號分子其作用具有時間性和空間性。當個細胞興奮時,產生了一個電沖動,此時,細胞外的鈣離子流入該細胞內,促使該細胞分泌神經遞質,神經遞質與相鄰的下一級神經細胞膜上的蛋白分子結合,促使這一級神經細胞產生新的電沖動。以此類推,神經信號便一級一級地傳遞下去,從而構成復雜的信號體系,終形成學習、記憶等大腦的高級功能。在哺乳動物神經系統中,鈣離子同樣扮演著重要的信號分子的角色。靜息狀態下大部分神經元細胞內鈣離子濃度約為50-100nM,而細胞興奮時鈣離子濃度能瞬間上升10-100倍,增加的鈣離子對于突觸囊泡胞吐釋放神經遞質的過程必不可少。眾所周知,只有游離鈣才具有生物學活性,而細胞質內鈣離子濃度由鈣離子的內外流平衡所決定,同時也受鈣結合蛋白的影響。細胞外鈣離子內流的方式有很多種,其中包括電壓門控鈣離子通道、離子型谷氨酰胺受體、煙堿型膽堿能受體(nAChR)和瞬時受體電位C型通道(TRPC)等。神經元鈣成像的原理就是利用特殊的熒光染料或鈣離子指示劑將神經元中鈣離子濃度的變化通過熒光強度表現出來,以反映神經元活性。該方法可以同時去觀察多個功能或位置相關的腦細胞。雙光子顯微鏡使用長波長脈沖光,是通過物鏡匯聚的。激光雙光子顯微鏡熒光壽命計數
其實電子顯微鏡相比光學顯微鏡的重要優勢或意義不在于放大倍數,而在于超高的分辨率。這兩者是不同的。一般來說,觀察時,除了放大物體外,還需要將其與其他相鄰物體區分開來。如果兩個相鄰粒子的圖像在光學顯微鏡下,即使放大很大程度,也可能看到兩個相交的亮點(艾里斑),沒有明顯的邊界(更不用說細節了),說明分辨率不夠。沒有分辨率談放大是沒有意義的。光學顯微鏡的分辨率極限是阿貝極限,大約是光波波長的一半。通常稱之為光學顯微鏡的放大極限,但準確的說應該叫分辨率極限。原因是光的衍射,根本原因是光的波粒二象性。電子衍射實驗證明了電子的波動性,所以在電子顯微鏡中用電子代替光是可能的。電子顯微鏡也有很多種,被攝體像REM。也有根據衍射規律觀察的電子顯微鏡,如低能電子衍射(LEED)和透射電子顯微鏡(TEM)。兩者主要用于觀察晶體,根據晶體的周期特性在倒易空間產生衍射像,借助埃爾沃德球或傅里葉變換將其變換到實空間,即可得到真實的晶體表面像。激光雙光子顯微鏡熒光壽命計數雙光子顯微鏡廠家就找滔博生物。
與普通顯微鏡相比,電子顯微鏡可以在更小的尺度上觀察事物,冷凍電子顯微鏡可以觀察活性生物大分子。雙光子顯微鏡有什么優勢?它能做普通光學顯微鏡做不到的事情嗎?原來雙光子顯微鏡可以準確穿透厚標本進行定點和***觀察!因為電磁波的波長越短,粒子越強,散射的影響越大。雙光子顯微鏡將激發光源改為長波長激光,增加了激光的穿透力,同時降低了對細胞的毒性。此外,由于雙光子激發效應只能發生在物鏡的焦點處,因此掃描精度極高,還可以提高激發光效率,減少掃描點以外的熒光物質的消耗。
雙光子的來源:飛秒激光的雙光子吸收理論早在1931年就由諾貝爾獎獲得者MariaGoeppertMayer提出,并在30年后因為激光而得到實驗驗證,但WinfriedDenk用了近30年才發明了雙光子顯微鏡。要理解雙光子的技術挑戰和飛秒激光發揮的重要作用,首先要理解非線性過程。雙光子吸收相當于和頻產生的非線性過程,需要極高的電場強度,電場取決于聚焦光斑的大小和激光脈沖寬度。聚焦光斑越小,脈沖寬度越窄,雙光子吸收效率越高。對于衍射極限顯微鏡,聚焦在樣品上的光斑大小只與物鏡NA和激光波長有關,所以關鍵變量只有激光脈沖寬度?;谝陨戏治?,能夠輸出高重復率(100MHz)的超短脈沖(100fs量級)的飛秒激光已經成為雙光子顯微鏡的標準激發光源。這再次顯示了雙光子顯微鏡的優勢:雙光子吸收只能在焦平面形成,而在焦平面之外,由于光強較低,無法激發,所以雙光子成像更清晰。雙光子顯微鏡有哪些分類呢?
配合雙光子激發技術,激光共聚掃描顯微鏡則能更好得發揮功效。那么,什么是雙光子激發技術呢?在高光子密度的情況下,熒光分子可以同時吸收2個長波長的光子使電子躍遷到較高能級,經過一個很短的時間后,電子再躍遷回低能級同時放出一個波長為長波長一半的光子(P=h/λ)。利用這個原理,便誕生了雙光子激發技術。雙光子顯微鏡使用長波長脈沖激光,通過物鏡匯聚,由于雙光子激發需要很高的光子密度,而物鏡焦點處的光子密度是比較高的,所以只有在焦點處才能發生雙光子激發,產生熒光,該點產生的熒光再次穿過物鏡,被光探頭接收,從而達到逐點掃描的效果。雙光子顯微鏡可以在小鼠的的任何部位進行有生命體成像。進口激光雙光子顯微鏡原理
雙光子顯微鏡在多個領域研究中已有許多成功實例。激光雙光子顯微鏡熒光壽命計數
配合了雙光子激發技術,激光共聚掃描顯微鏡則能更好得發揮功效。那么什么是雙光子激發技術呢?在高光子密度的情況下,熒光分子可以同時吸收2個長波長的光子使電子躍遷到較高能級,經過一個很短的時間后,電子再躍遷回低能級同時放出一個波長為長波長一半的光子(P=h/λ)。利用這個原理,便誕生了雙光子激發技術。雙光子顯微鏡使用長波長脈沖激光,通過物鏡匯聚,由于雙光子激發需要很高的光子密度,而物鏡焦點處的光子密度是比較高的,所以只有在焦點處才能發生雙光子激發,產生熒光,該點產生的熒光再穿過物鏡,被光探頭接收,從而達到逐點掃描的效果。激光雙光子顯微鏡熒光壽命計數