無細胞蛋白表達技術（CFPS）根據反應體系的設計可分為分批式（Batch）、雙層式（Bilayer）和連續交換式（CECF）三種主要形式。分批式是Zui基礎的形式，反應在單一試管中進行，操作簡單但受限于底物耗盡和副產物積累，表達時間通常只4小時，適合小規模篩選（如Promega的試劑盒）。雙層式通過密度差異將反應液與緩沖液分層，延長反應時間至8-20小時，日本CFS公司的產品采用此設計。連續交換式（CECF）通過半透膜連接反應室與供應室，持續補充底物并移除副產物，可將反應延長至24小時，產量明顯提高（如德國RTS系統的1mL及以上規模產品）使用T7 RNA聚合酶合成加帽mRNA，可提升??真核體外蛋白表達??效率。大腸桿菌誘導蛋白表達水平

體外蛋白表達技術的重點在于利用細胞裂解物中的生物合成機器（核糖體、tRNA、翻譯因子）在試管中直接合成蛋白質。以大腸桿菌系統為例：首先制備含T7啟動子的線性DNA模板，將其與商業化裂解物（如RocheRTS100）、能量混合物（ATP/GTP）及20種氨基酸混合，在37℃振蕩反應2-4小時即可完成蛋白表達。整個過程無需細胞培養與基因轉染，速度比傳統方法快10倍以上。例如，COVID19刺突蛋白RBD結構域的體外表達只需6小時，而HEK293細胞系統需5天。該技術的關鍵優勢是開放體系的可編程性——可直接添加非天然氨基酸（如Azidohomoalanine）合成定制化蛋白，為藥物偶聯物開發提供高效平臺。目的蛋白表達水平無細胞體系的開放性??允許直接添加非天然氨基酸，擴展了??體外表達蛋白??的化學多樣性。

提升體外蛋白表達效能的關鍵技術路徑包括：裂解物工程化改造： CRISPR敲除核酸酶/蛋白酶基因增強穩定性，或過表達分子伴侶（如GroEL/ES）改善折疊；能量再生系統強化： 耦合葡萄糖脫氫酶與ATP合成酶模塊，實現ATP持續再生；膜蛋白表達突破： 添加脂質納米盤（Nanodiscs）提供類膜環境，促進跨膜結構域正確折疊；高通量篩選適配： 微流控芯片實現萬級反應并行運行，單次篩選規模超越傳統細胞方法。這些策略共同推動該技術向 更高效率、更低成本、更廣適用性 演進。

無細胞蛋白表達技術（CFPS）的he xin組分包括細胞裂解物（如大腸桿菌、兔網織紅細胞或小麥胚芽提取物），其中含有核糖體、tRNA、氨酰-tRNA合成酶及轉錄/翻譯因子（如啟動/延伸/終止因子）。此外，系統需補充能量再生系統（如ATP、磷酸肌酸與肌酸激酶）以維持反應持續進行，以及底物（氨基酸、核苷酸）和輔因子（Mg2?、K?等）以支持蛋白質合成。例如，大腸桿菌S30提取物常通過敲除核酸酶和蛋白酶來提升蛋白穩定性。英國nuclera高通量微流控蛋白表達篩選系統可支持助力無細胞蛋白表達技術，如想更多關于該產品的信息，歡迎咨詢官方代理商上海曼博生物！真核型體外蛋白表達系統對??毒性蛋白研究??具有不可替代的價值，如凋亡相關蛋白caspase-3的可控表達。

在無細胞合成生物學的框架下，可編程分子制造引擎的he xin角色可讓體外蛋白表達充當。其模塊化特性允許研究者將生物系統解構為三個可du li操作的層級：信息層：DNA/mRNA模板作為信息載體，其啟動子強度（如T7系統表達量比SP6高3倍）與5'UTR二級結構（ΔG<-50 kJ/mol時翻譯效率銳減）可自由優化；執行層：裂解物中的核糖體作為分子機器，通過補充非天然氨基酸（如對疊氮苯丙氨酸）擴展產物化學空間；調控層：添加核糖核酸開關（Riboswitch）或適配體（Aptamer）實現反饋控制，例如當產物積累至閾值濃度時觸發終止子發卡結構折疊終止反應。這種分層控制使體外蛋白表達能夠驅動人工設計基因回路的構建，例如合成振蕩器系統中T7 RNA聚合酶的自抑制表達實現周期為120分鐘的蛋白質濃度波動，為構建人工細胞提供可控的時空動態基礎。兔網織紅細胞裂解物??含??成熟血紅蛋白合成機制??，能實現復雜酶活性分子的功能性蛋白表達。大規模蛋白表達protocol

小麥胚芽裂解物??尤其適用于??同位素標記的蛋白表達??用于NMR結構解析。大腸桿菌誘導蛋白表達水平

體外蛋白表達系統的明顯缺陷在于 缺乏真核細胞器結構，導致關鍵翻譯后修飾難以實現：糖基化不完整性： 裂解物中缺乏高爾基體轉運機制，只能生成高甘露糖型等簡單糖鏈，無法合成復雜雙觸角N-糖；磷酸化/乙酰化失衡： 激酶/磷酸酶網絡不完整，使信號通路蛋白的修飾狀態與生理條件差異明顯；二硫鍵錯配風險： 氧化還原環境調控不足導致多二硫鍵蛋白錯誤折疊率升高。這些局限使體外蛋白表達在 zhi liao性抗體等需精確修飾的蛋白生產中應用受限。大腸桿菌誘導蛋白表達水平