配合雙光子激發技術，激光共聚掃描顯微鏡則能更好得發揮功效。那么，什么是雙光子激發技術呢？在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時吸收2個長波長的光子使電子躍遷到較高能級，經過一個很短的時間后，電子再躍遷回低能級同時放出一個波長為長波長一半的光子（P=h/λ）。利用這個原理，便誕生了雙光子激發技術。雙光子顯微鏡使用長波長脈沖激光，通過物鏡匯聚，由于雙光子激發需要很高的光子密度，而物鏡焦點處的光子密度是比較高的，所以只有在焦點處才能發生雙光子激發，產生熒光，該點產生的熒光再穿過物鏡，被光探頭接收，從而能夠達到逐點掃描的效果。雙光子顯微鏡的基本原理是：在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時吸收 2 個長波長的光子。2PPLUS雙光子顯微鏡應用

基因編碼的熒光探針可用于在突觸和細胞分辨率下監測體內神經元信號，這是揭示動物神經活動復雜機制的關鍵。雙光子顯微鏡(2PM)可以對鈣離子傳感器和谷氨酸傳感器進行亞細胞分辨率的成像，從而測量不透明腦深部的活動。成像膜的電壓變化可以直接反映神經元的活動，但神經元活動的速度對于常規的2PM來說太快了。目前，電壓成像主要由寬視場顯微鏡實現，但其空間分辨率較差，且只能在淺深度成像。因此，為了以高空間分辨率成像不透明腦中膜電壓的變化，需要將成像速率提高2PM。面向模塊輸出端的子脈沖序列可視為從虛擬光源陣列發出的光，這些子脈沖在中繼到顯微鏡物鏡后形成空間分離和時間延遲的聚焦陣列。然后，該模塊被集成到一個帶有高速數據采集系統的標準雙光子熒光顯微鏡中，如圖2所示。光源是重復頻率為1MHz的920nm激光器。FACED模塊可以產生80個脈沖焦點，脈沖時間間隔為2ns。這些焦點是虛擬源的圖像。虛光源越遠，物鏡處的光束尺寸越大，焦點越小。光束可以沿Y軸比沿X軸更好地填充物鏡，從而在X軸上產生0.82m和0.35m的橫向分辨率。國內bruker雙光子顯微鏡商家雙光子顯微鏡品牌有哪些？

相比普通的顯微鏡電子顯微鏡可以觀察尺度更小的東西，冷凍電鏡更是可以觀察有活性的生物大分子，而雙光子顯微鏡有什么優勢呢？它能做到什么普通光學顯微鏡做不到的事情嗎？原來，雙光子顯微鏡可以精確穿透較厚標本進行定點、***觀察！由于電磁波的波長越短，粒子性越強，受散射影響也就越大。雙光子顯微鏡將激發光源改為長波長激光，在增加了激光的穿透性的同時還減少了對細胞的毒性。除此之外，因為只有物鏡焦點處能發生雙光子激發效應，所以掃描的精確度極高，也能提高激發光效率，減少被掃描點之外的熒光物質消耗。

首先我們來簡單介紹一下激光掃描共聚焦和雙光子這兩種當紅的顯微成像技術。激光掃描共聚焦顯微技術，是熒光顯微成像的一種，用于激發樣品的熒光信號并對其放大成像。在激光掃描共聚焦顯微鏡中，樣品焦平面上每一時刻只有一個點被激發光照射，縱然焦平面外也有激發光照射，但通過探測器前的（pinhole），有焦平面上的熒光信號能被探測器接收。也就是說，每個時刻，只有焦平面上一個點的信號被探測。通過點掃描的方式，一個個點的信號就可以組合出終的圖像。雙光子顯微鏡（包括多光子顯微鏡）同樣采用點掃描的方式得到圖像。不同的是，其采用的激發光波長較長，只有當兩個（或更多）激發光光子幾乎同時轟擊熒光探針的時候才可能激發出熒光信號。所以只有在光子密度特別大的焦點，出才會激發出熒光。也就是說，雙光子顯微鏡中，同樣每個時刻只有焦平面上一個點的信號被探測，并且連焦平面外的熒光信號也不會有。雙光子顯微鏡是新型的熒光顯微鏡，其原理大致是這樣的；

隨著技術的發展，雙光子顯微鏡的性能得到不斷地優化，結合它的特點，大致可以分成深和活兩個方面的提升。要想讓激發激光進入更深的層面，大致可從兩個方面入手，裝置優化與標本改造。關于裝置優化，我們可以把激光束變得更細，使能量更加集中，就能讓激光穿透更深。關于標本，其中影響光傳播的主要是物質吸收和散射，解決這個問題，我們需要對樣本進行透明化處理。一種方法是運用某種物質將標本浸泡，使其中的物質（主要是脂質）被破壞或溶解。另一種方法是運用電泳將脂質電解，進而讓標本“透明度”提高。在深度組織中以較長時間對細胞成像，雙光子顯微鏡是當前之選。進口激光雙光子顯微鏡成像技術

雙光子顯微鏡已延伸到各個領域研究中，它能對樣品進行三維觀察。2PPLUS雙光子顯微鏡應用

雙光子的來源:飛秒激光的雙光子吸收理論早在1931年就由諾貝爾獎獲得者MariaGoeppertMayer提出，并在30年后因為激光而得到實驗驗證，但WinfriedDenk用了近30年才發明了雙光子顯微鏡。要理解雙光子的技術挑戰和飛秒激光發揮的重要作用，首先要理解非線性過程。雙光子吸收相當于和頻產生的非線性過程，需要極高的電場強度，電場取決于聚焦光斑的大小和激光脈沖寬度。聚焦光斑越小，脈沖寬度越窄，雙光子吸收效率越高。對于衍射極限顯微鏡，聚焦在樣品上的光斑大小只與物鏡NA和激光波長有關，所以關鍵變量只有激光脈沖寬度。基于以上分析，能夠輸出高重復率(100MHz)的超短脈沖(100fs量級)的飛秒激光已經成為雙光子顯微鏡的標準激發光源。這再次顯示了雙光子顯微鏡的優勢:雙光子吸收只能在焦平面形成，而在焦平面之外，由于光強較低，無法激發，所以雙光子成像更清晰。2PPLUS雙光子顯微鏡應用