WinfriedDenk較初使用的光源是染料飛秒激光器(100fs脈寬、630nm可見光波長)。雖然染料激光器對于實驗室演示尚可，但是使用很不方便所以遠未實現商用。很快雙光子顯微鏡的標配光源就變成了飛秒鈦寶石激光器。除了固態光源優勢，鈦寶石激光器還具有較寬的近紅外波長調諧范圍，而近紅外相比可見光穿透更深，對生物樣品損傷更小。下圖是Thorlabs的雙光子和三光子顯微鏡配置，鈦寶石飛秒可調諧激光器位于平臺較左邊。科學家正在從雙光子轉向三光子顯微鏡。1996年，ChrisXu在康奈爾大學(Denk同導師實驗室)讀博期間發明了三光子顯微鏡，如果雙光子吸收可行，那么三光子看起來也是自然的發展方向。三光子成像使用更長的波長，大約在1.3和1.7微米，其成像深度也比雙光子更深，目前記錄約為2.2毫米，人類大腦皮層厚約4毫米。相比雙光子顯微鏡，三光子還要求以較低重頻使用更強和更短的激光脈沖，而傳統的鈦寶石激光器難以達到這些要求，但是對于摻鐿光纖飛秒光參量放大器則非常容易，比如我們的Y-Fi光參量放大器(OPA)。雙光子顯微鏡不需要共聚焦細孔，提高了熒光檢測效率。進口雙光子顯微鏡成像視野是多少

基因編碼的熒光探針可用于在突觸和細胞分辨率下監測體內神經元信號，這是揭示動物神經活動復雜機制的關鍵。雙光子顯微鏡(2PM)可以對鈣離子傳感器和谷氨酸傳感器進行亞細胞分辨率的成像，從而測量不透明腦深部的活動。成像膜的電壓變化可以直接反映神經元的活動，但神經元活動的速度對于常規的2PM來說太快了。目前，電壓成像主要由寬視場顯微鏡實現，但其空間分辨率較差，且只能在淺深度成像。因此，為了以高空間分辨率成像不透明腦中膜電壓的變化，需要將成像速率提高2PM。面向模塊輸出端的子脈沖序列可視為從虛擬光源陣列發出的光，這些子脈沖在中繼到顯微鏡物鏡后形成空間分離和時間延遲的聚焦陣列。然后，該模塊被集成到一個帶有高速數據采集系統的標準雙光子熒光顯微鏡中，如圖2所示。光源是重復頻率為1MHz的920nm激光器。FACED模塊可以產生80個脈沖焦點，脈沖時間間隔為2ns。這些焦點是虛擬源的圖像。虛光源越遠，物鏡處的光束尺寸越大，焦點越小。光束可以沿Y軸比沿X軸更好地填充物鏡，從而在X軸上產生0.82m和0.35m的橫向分辨率。進口雙光子顯微鏡熒光壽命計數雙光子顯微鏡為什么穿透能力強?

生物樣品的三維觀察是了解細胞功能的重要方法之一。目前已有的三維熒光成像技術有光學顯微鏡、點陣照明和激光掃描顯微鏡(如共焦顯微鏡和雙光子顯微鏡)。其中，激光掃描顯微鏡利用轉盤可以進行多焦點激光掃描，提高了時間分辨率，有利于減少活細胞成像中的光損傷。本文主要實現可見光雙光子激發和多焦點激光掃描的結合，**終提高三維延遲掃描中的空間分辨率和成像對比度，這也是可見光雙光子激發(v2PE)在超高分辨率顯微鏡中的應用。

WinfriedDenk使用的第1個光源是染料飛秒激光(脈沖寬度100fs，可見光波長630nm)。染料激光雖然實驗室演示可以接受，但是使用起來不方便，所以離商業化還很遠。很快雙光子顯微鏡的標準光源變成了飛秒鈦寶石激光器。鈦寶石激光器除了具有固態光源的優點外，還具有近紅外波長調諧范圍寬，而近紅外比可見光穿透更深，對生物樣品的損傷更小。下圖是Thorlabs的雙光子和三光子顯微鏡配置，鈦寶石飛秒可調諧激光器位于平臺左側。從雙光子到三光子科學家們正在從雙光子顯微鏡轉向三光子顯微鏡。1996年，ChrisXu在康奈爾大學(Denk的導師實驗室)讀博時發明了三光子顯微鏡。如果雙光子吸收是可行的，那么三光子似乎是自然的發展方向。三光子成像使用更長的波長，大約1.3和1.7微米，成像深度比雙光子更深。目前錄音大約2.2毫米，人的大腦皮層厚度大約4毫米。與雙光子顯微鏡相比，三光子需要使用更強、更短、重復率更低的激光脈沖，這是傳統的鈦寶石激光器很難滿足的，但對于摻鐿光纖飛秒光參量放大器，比如我們的Y-Fi光參量放大器(OPA)就非常容易。這種雙光子顯微鏡的視場是普通顯微鏡的10倍。

雙光子的來源:飛秒激光的雙光子吸收理論早在1931年就由諾貝爾獎獲得者MariaGoeppertMayer提出，并在30年后因為激光而得到實驗驗證，但WinfriedDenk用了近30年才發明了雙光子顯微鏡。要理解雙光子的技術挑戰和飛秒激光發揮的重要作用，首先要理解非線性過程。雙光子吸收相當于和頻產生的非線性過程，需要極高的電場強度，電場取決于聚焦光斑的大小和激光脈沖寬度。聚焦光斑越小，脈沖寬度越窄，雙光子吸收效率越高。對于衍射極限顯微鏡，聚焦在樣品上的光斑大小只與物鏡NA和激光波長有關，所以關鍵變量只有激光脈沖寬度。基于以上分析，能夠輸出高重復率(100MHz)的超短脈沖(100fs量級)的飛秒激光已經成為雙光子顯微鏡的標準激發光源。這再次顯示了雙光子顯微鏡的優勢:雙光子吸收只能在焦平面形成，而在焦平面之外，由于光強較低，無法激發，所以雙光子成像更清晰。雙光子顯微鏡有這么多優點，那么雙光子顯微鏡有哪些應用呢？國內激光雙光子顯微鏡分辨率是多少

雙光子顯微鏡能夠進行光裂解、光轉染和光損傷等光學操縱。進口雙光子顯微鏡成像視野是多少

隨著技術的發展，雙光子顯微鏡的性能得到不斷地優化，結合它的特點，大致可以分成深和活兩個方面的提升。要想讓激發激光進入更深的層面，大致可從兩個方面入手，裝置優化與標本改造。關于裝置優化，我們可以把激光束變得更細，使能量更加集中，就能讓激光穿透更深。關于標本，其中影響光傳播的主要是物質吸收和散射，解決這個問題，我們需要對樣本進行透明化處理。一種方法是運用某種物質將標本浸泡，使其中的物質（主要是脂質）被破壞或溶解。另一種方法是運用電泳將脂質電解，讓標本的“透明度”得到提高。進口雙光子顯微鏡成像視野是多少