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基因編輯定量脫靶檢測:基因編輯定量脫靶檢測,使用CRISPR/Cas9、ZFNs和TALENs等設計核酸酶進行基因組編輯，可以將遺傳物質定向導入哺乳動物基因組的特定位點。然而，可能會出現非預期的靶上和靶外基因組修飾，這可能導致基因組不穩定，并破壞正常基因的功能，從而可能導致臨床前和臨床研究中的安全問題。.基于PCR的檢測唯可生物采用LTA-PCR方法分析基因組編輯引起的靶向和非靶向整合。1.方便地檢測脫靶目標變化和隨機性2.適用于解決監管機構提出的具體問題3.定制化生物信息學分析基于NGS的檢測唯可生物使用靶向富集測序(TES)進行全基因組檢測和定量靶向和非靶向改變。我們可在一次反應中經濟高效...

先導編輯器：CBE和ABE組合使用可以有效地進行4種堿基轉換（C→T, G→A, A→G, T→C），而無需產生DSB，然而除了這4種堿基轉換，對另外8種堿基轉換（C→A, C→G, G→C, G→T, A→C, A→T, T→A, T→G）以及堿基的插入和缺失，依然缺乏有效的研究工具。先導編輯器（Prime Editor, PE），PE在不依賴DSB和供體DNA的條件下便可有效實現所有12種堿基轉換，此外還能有效實現多堿基的精細插入（較多可插入44bp）和刪除（較多刪除80bp）。> 抗CRISPR蛋白。抗CRISPR（Acr）蛋白是天然的CRISPR/Cas系統抑制劑，由各種可移動遺傳元件...

gRNA的長度和錯配： 17個核苷酸長度的gRNA顯示出更高的基因組編輯效率。相比之下，18-20 bp的長度顯示出較低的基因組編輯效率。在人類細胞中減少潛在脫靶效應的指導方針：1) 應避免在PAM的7-10 bp范圍內靶序列有超過3個錯配；2) 在PAM的12 bp內，應避免sgRNA 凸起以減少脫靶效應。gRNA的化學修飾：在gRNA核糖磷酸骨架中加入2?-O-甲基-3?-膦酰基乙酸酯會導致位點特異性修飾，使脫靶切割減少40-120倍，同時保持靶向性能。gRNA上游5'發夾結構的修飾可以提高Cas9和Cas12的特異性，降低脫靶效應。脫靶檢測CRO，推薦唯可生物，實驗實力強，專業性高，檢測...

長期隨訪的觀察時間長期隨訪的持續時間應確保足以觀察到受試者因產品特性、暴露情況（生物分布和給藥途徑）等導致的風險，應不短于遲發性不良反應的預期發生時間。一般而言，針對不同類型的基因zhiliao產品建議如下：?具有基因組整合活性的載體（例如γ-逆轉錄病毒和慢病毒載體）和轉座子元件建議觀察不短于15年。?可以產生持續ganran、或有潛伏再jihuo風險的細菌或病毒載體（如單純皰疹病毒）建議觀察15年或至數據表明不再存在任何風險（ganran或再jihuo）。基因編輯產品建議觀察15年或至數據表明不再存在任何風險。?腺相關病毒載體建議觀察5年或至數據表明不再存在任何風險。值得收藏的CRISPR脫...

目前鼓潤已掌握了該項技術，簡述如下：1、CRISPR與dsODNtag整合的實驗技術及高通量測序建庫流程將靶向于目標基因組位點的CRISPR質粒與dsODNtag以核電轉的方式同時轉染入真核細胞，CRISPR造成基因組雙鏈斷裂后，dsODNtag將整合入斷點處，作為后續分析在靶與脫靶情況的標記。轉染后3天收集細胞的DNA進行高通量建庫。2、GUIDE-seq生信分析方法1）搭建了高通量測序的數據分析流程。2）利用該技術分析了CRISPR靶向編輯某細胞系基因的在靶與脫靶情況。其中一例樣品的分析結果如圖4所示：Sequencesofoff-targetsitesidentifiedbyGUIDE-...

當基因zhiliao產品在生殖qiguan持續存在時，需要進一步研究確定其在生殖細胞（例如卵母細胞、精子）的暴露水平。根據載體類型、復制能力、基因組整合特性、劑量水平、給藥途徑等因素，分析評估基因zhiliao產品生殖系整合風險。遺傳毒性，基因zhiliao產品將遺傳物質轉移到宿主細胞內或整合到宿主基因組中或對宿主基因組進行編輯，存在潛在的遺傳毒性風險。目前對于判斷細胞基因組插入/修飾是否會產生遺傳毒性、是否較終會發生變依然還缺乏系統的認知，因此，需要分析基因組改變（載體或遺傳物質整合進基因組、對基因組編輯等）的特征，并評估相關潛在風險。選擇潛在的脫靶位點，例如選擇gRNA預測網站上Top 5...

長期表達。與其他產品相比，部分基因zhiliao產品的明顯特征是可以在患者靶細胞或基因修飾細胞中持續存在并編碼表達作用因子（功能性蛋白或基因表達調節元件），并通過長久或長期改變靶細胞或組織的功能來達到zhiliao效果。同時，由于基因zhiliao編碼的作用因子在體內的長期暴露或表達異常，可能產生與其功能相關的長期安全性風險，如細胞生長失控和惡性liu形成、自身免疫反應或其他無法預測的遲發性不良反應。潛伏再jihuo。部分病毒類基因zhiliao產品可能存在從潛伏期被再jihuo的可能性或者引起機體中已有病毒ganran的再jihuo，存在ganran相關的遲發性不良反應的風險。脫靶檢測報告，...

由于設計的sgRNA會與非靶點DNA序列錯配，引入非預期的基因突變，即脫靶效應(Off-targeteffects)。脫靶效應造成了研究中的許多不確定性，這無疑限制了該技術的應用。因此，研究者希望能開發有效的方法來檢測脫靶效應。在目前主流的脫靶效應評估方法中，有一種方法為GUIDE-seq，其原理是利用一種短的雙鏈寡聚核苷酸（dsODN）標記CRISPR/Cas誘導的脫靶斷裂，然后對標簽所在的基因組區域進行高通量測序，通過生物信息學分析從而確定脫靶位點。利用該技術可以在基因組范圍內檢測CRISPR脫靶效應，從而改變了以往先預測假定脫靶位點再檢測的思路；與其他的評估方法相比，GUIDE-seq更...

改進Cas變體使用SpCas9和SaCas9 變體：已研發出諸如SpCas9-Nickase、dCas9 、dCas9–FokI、xCas9、Cas9-NG、evoCas9、SpCas9 – HFI、eSpCas9和Hypa-Cas9等多種Cas變體，可降低脫靶效應。改進的Cas9同源物具有更廣的PAM功能和特異性：實驗表明Cpf1、CRISPR-Cpf1-RNP可降低脫靶效應。CRISPR 遞送方法：基于病毒的遞送方法：腺病毒 (AdV) 顯示出整合到靶細胞基因組中的微弱潛力，這一特征有利于限制脫靶效應。然而，AdVs 會引發免疫反應，目前還不能完全排除它與宿主基因組整合的可能性。非病毒遞送...

使用CRISPR/Cas9、ZFNs和TALENs等設計核酸酶進行基因組編輯，可以將遺傳物質定向導入哺乳動物基因組的特定位點。然而，可能會出現非預期的靶上和靶外基因組修飾，這可能導致基因組不穩定，并破壞正常基因的功能，從而可能導致臨床前和臨床研究中的安全問題。基因編輯目前的脫靶分析技術主要依賴于生物信息學預測和全基因組脫靶檢測技術。這些預測缺乏可靠性，因為它們只涵蓋了潛在基因組改變的一小部分。而頻率低于0.5%的脫靶突變大多無法被全基因組脫靶檢測技術檢測到。我們是開發用于全基因組靶向/非靶向分析的無偏分析的先驅。靶向基因組編輯唯可生物為基因編輯安全性評估提供多方面的PCR和基于NGS的分析。我...

細胞經基因修飾后會改變其生物學特性，同時也會帶來新的安全性風險，如基因編輯脫靶風險、載體插入突變風險、載體重組風險、表達的轉基因產物的風險等。在制定非臨床研究計劃時，除參考《細胞zhilliao產品研究與評價技術指導原則》（試行）中的對細胞zhilliao產品的一般要求外，還應具體問題具體分析，基于產品特點和目前已有的科學認知，結合擬定適應癥、患者人群、給藥途徑和給yaofang案等方面的考慮，科學合理的設計和實施非臨床研究，充分表征產品的藥理學、毒理學和藥代動力學特征。在進行獲益風險評估時，還應重點關注由非臨床向臨床過渡時非臨床研究的局限性和風險預測的不確定性。脫靶檢測技術，推薦唯可生物，實...

CIRCLE-seq原理。細胞內檢測方法由于提純的基因組已經消化去除了組蛋白，結構較細胞內的染色質更為松散，理論上容易找到更多的脫靶位點。為捕獲CRISPR在細胞內工作時真實發生的脫靶切割，研究者們也設計了一些細胞內的脫靶位點檢測方法。1) Guide-seqCRISPR造成DNA雙鏈斷裂后，由于DNA修復機制的存在，斷裂處很快就會重新連接，這時候提純基因組DNA很難保留CRISPR造成的DNA斷裂位點。所以為了記錄細胞內真實的CRISPR脫靶切割，研究者們設計了Guide-seq[10]，利用NHEJ的DNA修復機制，將一段雙鏈短核苷酸序列（dsODN）連接到CRISPR造成的DNA雙鏈斷裂...

自基因zhiliao出現之日起，安全性問題就隨之產生了，并成為阻礙基因zhiliao研發的一大障礙，吳寧博士認為：“基因zhiliao產品的研發和上市，安全性會將是一個非常重要考量。如果一款產品它安全性有問題的話，在市場化道路上就會受到很大影響。尤其是基因zhiliao，目前處于起始階段，一旦出現不良事件，很有可能對整個行業都會產生致命打擊。具體說來，基因zhiliao的安全性問題主要涉及基因插入突變、脫靶、生物分布和持久性、潛伏再jihuo以及潛在免疫原性等。”脫靶切割位點已在基因編輯技術,CRISPR / Cas9,ZFNs和TALEN。南京基因療法脫靶檢測評估標準由于設計的sgRNA會與...

CAR或TCR修飾的免疫細胞對于嵌合抗原受體（Chimericantigenreceptor，CAR）或T細胞受體（Tcellreceptor，TCR）修飾的免疫細胞，應盡可能采用多種方法評估其靶點相關毒性和脫靶毒性風險。對于靶點相關毒性，應采用體外方法深入分析靶點在人體qiguan、組織和細胞中的表達分布情況，基因表達分析庫和文獻調研也可能會有助于闡明靶點在不同病理生理狀態下的表達是否存在差異。應采用表達和不表達靶抗原的細胞作為靶細胞進行體外試驗，確認CAR或TCR修飾的免疫細胞可特異性的識別和殺傷靶細胞。對于CAR修飾的免疫細胞，應采用多種體外方法評估其胞外抗原識別區的脫靶風險。如何降低脫...

對基于慢病毒/逆轉錄病毒載體的基因zhiliao產品，如出現與可復制xingbing毒可能相關的不良事件，還應開展可復制xingbing毒（replicablecompetentlentivirus/retrovirus，RCL/RCR）的檢測。關于基因編輯產品的特殊考慮基因編輯產品除了適用基因zhiliao產品的一般考慮以及整合性載體的特殊考慮外，長期隨訪中還應額外關注脫靶風險，量化評估脫靶活性和在靶活性之間的相關性，或利用在靶活性來預測脫靶活性的水平。如果基因zhiliao產品通過全身給yaofang式遞送，長期隨訪中的安全性監測不僅包括靶qiguan或靶組織的脫靶活性，而且還應包括可能發...

堿基編輯器：CBE：胞嘧啶堿基編輯器(Cytosine base editor，CBE)，依賴于胞嘧啶核苷脫氨基酶，通過將胞嘧啶核苷脫氨轉換為尿嘧啶核苷，尿嘧啶核苷在DNA復制和修復過程中會轉換為胸腺嘧啶核苷，從而實現C到T的轉換。已開發出四代CBE（BE1、BE2、BE3和BE4），由于BE3引起的脫靶效應相對較少，因此它已在動物（小鼠）、細菌和植物細胞中廣用于編輯細胞的基因組成。腺嘌呤堿基編輯器(Adenine base editor，ABE)，依賴于腺嘌呤核苷脫氨基酶，通過將腺嘌呤核苷脫氨轉換為次黃苷，然后在DNA復制和修復過程中會轉換為鳥嘌呤核苷，從而實現腺嘌呤(A)到鳥嘌呤(G)的轉...

CAR或TCR修飾的免疫細胞對于嵌合抗原受體（Chimericantigenreceptor，CAR）或T細胞受體（Tcellreceptor，TCR）修飾的免疫細胞，應盡可能采用多種方法評估其靶點相關毒性和脫靶毒性風險。對于靶點相關毒性，應采用體外方法深入分析靶點在人體qiguan、組織和細胞中的表達分布情況，基因表達分析庫和文獻調研也可能會有助于闡明靶點在不同病理生理狀態下的表達是否存在差異。應采用表達和不表達靶抗原的細胞作為靶細胞進行體外試驗，確認CAR或TCR修飾的免疫細胞可特異性的識別和殺傷靶細胞。對于CAR修飾的免疫細胞，應采用多種體外方法評估其胞外抗原識別區的脫靶風險。脫靶檢測技...

基因重排或重組。當基因zhiliao產品所用載體及其攜帶的基因發生復制時，可能出現非zhiliao目的非預期的基因表達或改變，或者與相應野生型或輔助病毒互補后產生回復突變或意外復制或形成6新的病毒。免疫原性。由于基因zhiliao產品在體內的持續暴露或者需要多次給藥等情況，機體可能產生針對基因zhiliao載體或編碼的作用因子的免疫應答。由于基因zhiliao產品在靶細胞或組織中的表達時間、分布范圍或表達強度等差異，機體免疫應答的后果可能從不具有臨床意義的一過性的免疫反應，到針對靶細胞或組織的免疫攻擊，甚至產生嚴重危及生命的不良事件。種子基因脫靶檢測，推薦唯可生物，實驗實力強，專業性高，檢測效...

國內外基因zhiliao產品開展的非臨床研究、長期隨訪獲得的臨床經驗以及基因組整合位點分析方法的明顯改進，都有助于更好地理解整合性基因zhiliao載體相關風險。通常認為，很多能夠介導外源基因轉入細胞核的載體（如逆轉錄病毒載體、轉座子元件和基因編輯產品等）有基因組整合潛力，需要通過長期隨訪觀察遲發性不良反應的風險；根據目前的認識和研究數據，質粒、痘病毒、腺病毒和腺相關病毒（AAV）等載體的基因zhiliao產品整合風險較低，國際上開展的臨床試驗中也表現出較低的遲發性不良反應風險。當載體或基因zhiliao產品原有的風險特征增加時，例如經過修飾以攜帶基因組編輯成分的質粒或改變給yaofang式以...

誘導多能干細胞來源的細胞產品。誘導多能干細胞（inducedpluripotentstemcell，iPS）自身具有致瘤性風險，在體內可形成畸胎瘤，整合病毒載體的使用和誘導多能性可能增加iPS細胞插入致突變性和致性的風險。因此，應在shou次臨床試驗前完成致瘤性試驗。若設計科學合理，能夠滿足評價要求，也可在持續時間足夠長的毒性研究中評估致瘤性風險。體內致瘤性試驗建議采用摻入未分化iPS細胞的細胞產品作為陽性對照，以確認實驗系統的靈敏度。如果iPS細胞設計了機制以降低致瘤風險，應在體內試驗中確認/驗證此類機制的功能 脫靶檢測報告，推薦唯可生物，實驗實力強，專業性高，檢測效率高，結果準確率高。...

基因zhiliao產品特有的可能會引起遲發性不良反應的風險因素包括：基因組整合活性基因zhiliao產品可能會采用修飾宿主基因組的技術，并有可能在宿主細胞或組織中持續存在。很多基因zhiliao載體的基因整合不會指向基因組的特定位點，可能在整合位點處產生插入突變、或jihuo整合位點附近的原基因等，進而破壞重要基因功能或增加惡性liu的風險，例如，國外已有多項研究報告在接受了使用γ-逆轉錄病毒載體轉導的基因修飾細胞zhiliao的受試者中發生白血病。因此，對于存在此類風險的產品，有必要進行長期隨訪臨床研究以評估出現遲發不良反應的風險。脫靶檢測評估，推薦唯可生物，實驗實力強，專業性高，檢測效率高...

CIRCLE-seq和CHANGE-seq與SITE-seq同期發表的CIRCLE-seq一定程度上解決了SITE-seq的一些問題。CIRCLE-seq的第一步是將純化后的基因組DNA隨機打斷成300bp左右的片段，然后首尾相連成環狀DNA，這種方法很好地避免了DNA隨機斷裂造成的背景噪聲。實驗的第二步是用Cas9切割環狀DNA，再連上接頭并進行雙端測序，這樣就可以在一次測序中同時獲取切割位點的兩側序列，彌補了SITE-seq的另一個缺點。CIRCLE-seq從總體上來說要優于SITE-seq，但是將基因組DNA隨機打斷后成環的效率并不高，所以同一作者在3年后發表了CHANGE-seq，用T...

使用CRISPR/Cas9、ZFNs和TALENs等設計核酸酶進行基因組編輯，可以將遺傳物質定向導入哺乳動物基因組的特定位點。然而，可能會出現非預期的靶上和靶外基因組修飾，這可能導致基因組不穩定，并破壞正常基因的功能，從而可能導致臨床前和臨床研究中的安全問題。基因編輯目前的脫靶分析技術主要依賴于生物信息學預測和全基因組脫靶檢測技術。這些預測缺乏可靠性，因為它們只涵蓋了潛在基因組改變的一小部分。而頻率低于0.5%的脫靶突變大多無法被全基因組脫靶檢測技術檢測到。我們是開發用于全基因組靶向/非靶向分析的無偏分析的先驅。靶向基因組編輯唯可生物為基因編輯安全性評估提供多方面的PCR和基于NGS的分析。我...

由于設計的sgRNA會與非靶點DNA序列錯配，引入非預期的基因突變，即脫靶效應(Off-targeteffects)。脫靶效應造成了研究中的許多不確定性，這無疑限制了該技術的應用。因此，研究者希望能開發有效的方法來檢測脫靶效應。在目前主流的脫靶效應評估方法中，有一種方法為GUIDE-seq，其原理是利用一種短的雙鏈寡聚核苷酸（dsODN）標記CRISPR/Cas誘導的脫靶斷裂，然后對標簽所在的基因組區域進行高通量測序，通過生物信息學分析從而確定脫靶位點。利用該技術可以在基因組范圍內檢測CRISPR脫靶效應，從而改變了以往先預測假定脫靶位點再檢測的思路；與其他的評估方法相比，GUIDE-seq更...

脫靶來自于這些技術所攜帶的功能基團，如堿基編輯的脫氨酶和先導編輯的逆轉錄酶，不依賴sgRNA結合基因組DNA的情況下產生的脫靶。為檢測第二類脫靶現象，研究者需要針對每種技術設計專門的檢測方法。1) R-loop seq在堿基編輯開發早期，雖然靶位點的編輯效率很高，但研究者也很快發現脫氨酶會在游離的時候隨機修飾暴露的DNA單鏈，導致大量的脫靶位點。為降低這類脫靶現象的發生，研究者設計了R-loop seq，以dSaCas9結合DNA形成R-loop，暴露出DNA單鏈，為堿基編輯的脫氨酶提供一個固定的脫靶位點，然后以該位點的編輯效率反映堿基編輯脫氨酶的脫靶程度。內基因編輯技術可能造成的脫靶效應。浙...

基因zhiliao產品特有的可能會引起遲發性不良反應的風險因素包括：基因組整合活性基因zhiliao產品可能會采用修飾宿主基因組的技術，并有可能在宿主細胞或組織中持續存在。很多基因zhiliao載體的基因整合不會指向基因組的特定位點，可能在整合位點處產生插入突變、或jihuo整合位點附近的原基因等，進而破壞重要基因功能或增加惡性liu的風險，例如，國外已有多項研究報告在接受了使用γ-逆轉錄病毒載體轉導的基因修飾細胞zhiliao的受試者中發生白血病。因此，對于存在此類風險的產品，有必要進行長期隨訪臨床研究以評估出現遲發不良反應的風險。針對已經獲得的有切割能力的sgRNA，需要進一步明確其體內脫...

圍繞大家關心的CRISPR基因編輯安全性問題，我們首先對CRISPR脫靶位點檢測技術進行一次大盤點，在sgRNA設計階段需要如何做才能夠盡可能地避免脫靶現象的發生。較簡單的脫靶位點檢測方法是全基因組測序（WGS），但在實際使用中，即使測序深度達到100X，也很難發現一些低頻率的脫靶位點，同時測序成本卻非常高。為彌補WGS的這些缺陷，常見的脫靶位點檢測技術都需要對脫靶位點進行捕獲富集，來提高檢測靈敏度，降低測序成本。按照實驗原理的不同，脫靶位點檢測技術可以分為細胞外、細胞內和其他特殊方法這3類。種子脫靶檢測，推薦唯可生物，實驗實力強，專業性高，檢測效率高，結果準確率高。南京種子脫靶檢測安全性評價...

先導編輯器：CBE和ABE組合使用可以有效地進行4種堿基轉換（C→T, G→A, A→G, T→C），而無需產生DSB，然而除了這4種堿基轉換，對另外8種堿基轉換（C→A, C→G, G→C, G→T, A→C, A→T, T→A, T→G）以及堿基的插入和缺失，依然缺乏有效的研究工具。先導編輯器（Prime Editor, PE），PE在不依賴DSB和供體DNA的條件下便可有效實現所有12種堿基轉換，此外還能有效實現多堿基的精細插入（較多可插入44bp）和刪除（較多刪除80bp）。> 抗CRISPR蛋白。抗CRISPR（Acr）蛋白是天然的CRISPR/Cas系統抑制劑，由各種可移動遺傳元件...

Cas9蛋白是一種切割外來DNA的酶，像一把分子剪刀。該蛋白通常與兩個RNA分子結合：crRNA和另一個稱為tracrRNA（或“反式jihuocrRNA”）。這兩個RNA分子引導Cas9到它將進行切割的目標部位。這段DNA是與crRNA的20個核苷酸互補的。CRISPR技術是從細菌和古細菌的自然防御機制中改編而來的。這些生物體使用CRISPR衍生的RNA和各種Cas蛋白，包括Cas9，來阻止病毒和其他異物的攻擊。它們主要通過切碎和破壞外來入侵者的DNA來做到這一點。當這些組件被轉移到其他更復雜的生物體中時，它允許對基因進行操縱，或“編輯”。通過對DSB的標記實現了全基因組無偏脫靶檢測，如ID...

如果基因zhiliao產品通過全身給xingfang式遞送，長期隨訪中的安全性監測不僅包括靶qiguan或靶組織的脫靶活性，而且還應包括可能發生在其他組織和qiguan中的脫靶活性。基因組整合性或者脫靶活性的分析通常需采用有創性12檢測方法取得樣本，實施時還需要考慮技術和倫理上的可行性，例如靶向視網膜或肝臟等組織的基因zhiliao產品，可能難以對靶細胞采樣，這種情況下可能需要通過密切的臨床隨訪等方式間接評估風險；同時，選擇易于采樣的替代細胞也可能提供關于相關信息，例如靶向骨髓造血干細胞的基因zhiliao產品，可以通過采集外周血細胞或富集外周血干細胞進行觀察。脫靶檢測guide-sequen...